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核酸凝膠電泳染料該如何選擇?
源葉生物 / 2024-11-26

 

  凝膠電泳是我們基本的分子實驗。其基本原理是電泳分子在電場作用下移動,因此它同電場的強度、電泳分子本身所帶的凈電荷數(shù)成正比。由于在電泳中使用了無反應活性的穩(wěn)定的支持介質,從而降低了對流運動,故電泳的遷移率又同分子的摩擦系數(shù)成反比的。目前實驗室中常用的瓊脂糖凝膠電泳染料有EB、GeneFinderTM、GoldViewTM、SybrGreenI、GelRed和GelGreen。

下面對這幾種核酸染料一一進行分析

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1、溴化乙錠(EB)由于其價格便宜、使用方便已成為常用的核酸染料,被廣泛應用于觀察、檢測瓊脂糖凝膠與聚丙烯酰胺凝膠中的DNA或RNA。然而EB是一種強誘變劑,具有中等毒性,對皮膚、眼睛、口腔和上呼吸道系統(tǒng)有刺激性作用,對人體有潛在危害性。且廢棄的EB染液易污染環(huán)境。EB本身在紫外下不發(fā)光,與單鏈、雙鏈或三鏈DNA結合后發(fā)出明亮的熒光,EB-DNA結合物會導致染料的光漂白和DNA單鏈斷裂,且具有潛在的誘變作用。EB的使用方法簡單,可在制膠時將其加入進行前染,也可在電泳結束后進行后染。前染有利于節(jié)約時間,但是易出現(xiàn)條帶變形拖尾等問題,后染較費時,但效果較好。

 

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2. 綠色熒光核酸染料是一種可代替溴化乙錠(EB)的新型DNA染料,其靈敏度與 EB 相當,使用方法與之完全相同。在紫外燈下雙鏈DNA呈現(xiàn)綠色熒光,而單鏈 DNA 呈紅色熒光。

 

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3. GoldViewTM也是一種可代替溴化乙錠(EB)的新型核酸染料,采用瓊脂糖電泳檢測DNA時,GoldViewTM與核酸結合后能產(chǎn)生很強的熒光信號,其靈敏度與EB相當,使用方法與之完全相同。GoldView對于大片段DNA的染色效果較好,但對于500 bp以下的片段效果并不理想,而且它的熒光基團在紫外燈下非常容易淬滅,一般約5-10min條帶就會消失。所以應盡快拍照、觀察。另外,GoldView靈敏度差,本底色嚴重,不適用于切膠回收。且其毒性較大,尤其在紫外燈下,其誘導突變能力極高。

 

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4. SybrGreenI也是一種常用的核酸染料,它與雙鏈DNA(dsDNA)結合后,熒光大大增強,檢測的靈敏度也高于EB。在紫外照射透視下,與雙鏈DNA接合的SybrGreenI呈現(xiàn)明亮的綠色熒光,但其穩(wěn)定性較差(怕光、怕熱),使得染色的重復性較低。它對于50 bp以下的DNA片段染色能力缺失而對小于l00 bp的DNA片段檢測靈敏度也較低。SybrGreenI的使用同樣簡單,致變性也比EB低,但仍然不能保證實驗者的安全性,同時其高昂的價格也限制了它的廣泛使用。

 

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5. GelRed和GelGreen是集高靈敏、安全和高穩(wěn)定性于一身極佳的熒光核酸染料。其通過美國環(huán)保局安全認定,廢棄物可直接倒入下水道,而不會造成任何環(huán)境污染。目前大多數(shù)商業(yè)化的核酸染料總是在靈敏度、穩(wěn)定性和安全性等方面不完全令人滿意,而GelRed和GelGreen的上市改變了這一現(xiàn)狀。GelRed和GelGreen無論用于預制凝膠染色還是凝膠電泳后的染色,都表現(xiàn)出了的實驗效果。為配合紫外凝膠成像系統(tǒng)而設計的GelRed,其使用方法與EB一樣極其方便簡單。GelRed在預制凝膠中使用時仍然有極高的靈敏度,且在檢測低濃度、微量DNA方面也表現(xiàn)出極高的靈敏度,尤其對小分子量的DNA檢測非常靈敏。GelGreen則可以滿足使用藍色可見光激光凝膠掃描儀或者可見光激發(fā)的DarkReader的研究人員的使用。GelGreen無論是在預制凝膠還是凝膠電泳后的染色中都優(yōu)于SybrGreenI,且不存在后者的不穩(wěn)定性問題。GelRed和GelGreen均有較強的穩(wěn)定性,可以長期在室溫下保存,且這兩種染料的熱穩(wěn)定性也極高,在電泳緩沖溶液中時,均可用微波爐加熱且不發(fā)生變性。含有染料的預制凝膠可成批制備,長期保存?zhèn)溆?。GelRed和GelGreen與EB或SybrGreenI等其他核酸染料相比安全性得到了極大的提高。獨立的測試服務公司進行的標準艾姆斯氏測試結果表明,GelRed和GelGreen的特殊化學結構使其難以穿透細胞膜進入細胞,正是這一特性保證了實驗者的安全,使實驗者可以更加放心做實驗。

 


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